Средњовековна збирка броји преко 800 предмета који потичу углавном из Ниша и околних села, али има доста предмета и са територије која превазилази оквире данашње територијалне надлежности Музеја.
Предмети се датују у широком хронолошком распону од IV/V па све до XVI/XVII века, када се и датује комплет златног накита, случајни налаз са територије града Ниша. Начином израде и представом на њима посебно се истичу предмети попут већег реликвијара из XII века из Ореовца код Ниша са сценом Распећа и фигуром Богородице и врх партизане (спонтона), церемонијалног оружја пронађеног у непосредној близини рушевина старе цркве у околини Куршумлије.