Двадесети век је за љубитеље историје у Нишу почео на најлепши могући начин – 1900. године, приликом изградње тврђавског моста, пронађен је бронзани портрет Константина Великог. Овај вредни случајни налаз је требало негде сместити и тада се зачела идеја о потреби формирања музеја. Обележавање јубилеја ‒ 1600 година од доношења Миланског едикта 1913. године ‒ оживело је интересовање за ову идеју, чију су реализацију одложили Балкански ратови и Први светски рат. У новоформираној Краљевини Срба, Хрвата и Словенаца тридесетих година стекли су се услови за оснивање музеја Ниша.
Народни музеј у Нишу основала је 1. априла 1933. године група заљубљеника окупљена око те године основаног Музејског друштва, чији су најистакнутији чланови уједно били и његови оснивачи – Адам Оршић Славетић, Рудолф Братанић, Боривоје Гојковић, Александар Ненадовић и Боривоје Поповић.
Музеј је првих месеци свог постојања био привремено смештен у згради Учитељског дома и прву изложбу постављену у овом простору видело је неколико хиљада посетилаца. Пола године након свог оснивања, 22. октобра 1933. године, Музеј се сели у кућу Христодулуових, када је и званично отворен под именом Историјско-етнографски музеј града Ниша.
Материјал је био разврстан у седам збирки (праисторија, антика, средњи век, нумизматика, етнографија, збирка уметничких слика и збирка оружја). Захваљујући смештајним капацитетима и могућностима презентације, ова стална музејска поставка, по концепцији, стручном раду и богатству експоната представљала је једну од најбогатијих у Србији.
У периоду 1934‒1939. године, иако без регулисаног питања финансирања, Управа је организовала бројне истраживачке радове на простору Ниша и његове околине. У археолошким истраживањима учествовала су ондашња велика имена археологије – Никола Вулић, Јован Ковачевић, Боривоје Поповић и Владимир Фјукс. Подигнута је зграда музеја на Медијани и покренуто издавање „Моравско археолошког гласника”. Други светски рат прекинуо је једну од плоднијих етапа у развоју Музеја. Огромну штету нанело је савезничко бомбардовање Ниша, 2. септембра 1944. године, када је зграда Музеја страдала од директног поготка бомбе а са њом уништен и велики број прикупљених предмета.
После Другог светског рата, Народни одбор Општине Ниш обновио је Музеј под називом Народни музеј (1947). Будући да је у ратном вихору остао без комплетне етнографске збирке, а друге збирке су биле преполовљене, музејски посленици подухватили су се опсежног задатка ‒ анимирати свест код грађана о потреби за сакупљањем старина. Поред откупа и поклона, музејске збирке су се попуњавале и путем археолошких истраживања.
Музеј је 1950. године пресељен у нове просторије у којима се налази и данас. У зграду у улици Станка Пауновића (данас Генерала Милојка Лешјанина) смештено је историјско одељење под називом Музеј НОБ-а, а у згради бивше банке, у улици Петог конгреса (данашња Николе Пашића) изложена је стална археолошка поставка. Године 1951. основана је Уметничка галерија у Синагоги, а наредне године отворено је Меморијално одељење „Мија Станимировић”, чија је поставка скинута 1957. године. Стална поставка Меморијалног комплекса „12. фебруар” отворена је 1967. године.
У овом периоду начињен је велики искорак у музеолошкој презентацији, највише захваљујући помоћи познатих научних радника из Београда, међу којима су предњачили Ђорђе Мано Зиси, Милутин Гарашанин и Миодраг Грбић. Они су иницирали формирање нове сталне археолошке поставке 1965. године.
Музеј у својим фондовима данас има преко 40.000 предмета из области археологије, нумизматике, епиграфике, историје, историје уметности и етнологије а поседује и две спомен-збирке, Стевана Сремца и Бранка Миљковића. Посебност Музеја огледа се у чињеници да се у његовом саставу налазе и три непокретна културна добра од изузетног значаја: археолошко налазиште Медијана, споменик Ћеле-кула и Меморијални комплекс „12. фебруар”.