Dvadeseti vek je za ljubitelje istorije u Nišu počeo na najlepši mogući način – 1900. godine, prilikom izgradnje tvrđavskog mosta, pronađen je bronzani portret Konstantina Velikog. Ovaj vredni slučajni nalaz je trebalo negde smestiti i tada se začela ideja o potrebi formiranja muzeja. Obeležavanje jubileja ‒ 1600 godina od donošenja Milanskog edikta 1913. godine ‒ oživelo je interesovanje za ovu ideju, čiju su realizaciju odložili Balkanski ratovi i Prvi svetski rat. U novoformiranoj Kraljevini Srba, Hrvata i Slovenaca tridesetih godina stekli su se uslovi za osnivanje muzeja Niša.
Narodni muzej u Nišu osnovala je 1. aprila 1933. godine grupa zaljubljenika okupljena oko te godine osnovanog Muzejskog društva, čiji su najistaknutiji članovi ujedno bili i njegovi osnivači – Adam Oršić Slavetić, Rudolf Bratanić, Borivoje Gojković, Aleksandar Nenadović i Borivoje Popović.
Muzej je prvih meseci svog postojanja bio privremeno smešten u zgradi Učiteljskog doma i prvu izložbu postavljenu u ovom prostoru videlo je nekoliko hiljada posetilaca. Pola godine nakon svog osnivanja, 22. oktobra 1933. godine, Muzej se seli u kuću Hristoduluovih, kada je i zvanično otvoren pod imenom Istorijsko-etnografski muzej grada Niša.
Materijal je bio razvrstan u sedam zbirki (praistorija, antika, srednji vek, numizmatika, etnografija, zbirka umetničkih slika i zbirka oružja). Zahvaljujući smeštajnim kapacitetima i mogućnostima prezentacije, ova stalna muzejska postavka, po koncepciji, stručnom radu i bogatstvu eksponata predstavljala je jednu od najbogatijih u Srbiji.
U periodu 1934‒1939. godine, iako bez regulisanog pitanja finansiranja, Uprava je organizovala brojne istraživačke radove na prostoru Niša i njegove okoline. U arheološkim istraživanjima učestvovala su ondašnja velika imena arheologije – Nikola Vulić, Jovan Kovačević, Borivoje Popović i Vladimir Fjuks. Podignuta je zgrada muzeja na Medijani i pokrenuto izdavanje „Moravsko arheološkog glasnika”. Drugi svetski rat prekinuo je jednu od plodnijih etapa u razvoju Muzeja. Ogromnu štetu nanelo je savezničko bombardovanje Niša, 2. septembra 1944. godine, kada je zgrada Muzeja stradala od direktnog pogotka bombe a sa njom uništen i veliki broj prikupljenih predmeta.
Posle Drugog svetskog rata, Narodni odbor Opštine Niš obnovio je Muzej pod nazivom Narodni muzej (1947). Budući da je u ratnom vihoru ostao bez kompletne etnografske zbirke, a druge zbirke su bile prepolovljene, muzejski poslenici poduhvatili su se opsežnog zadatka ‒ animirati svest kod građana o potrebi za sakupljanjem starina. Pored otkupa i poklona, muzejske zbirke su se popunjavale i putem arheoloških istraživanja.
Muzej je 1950. godine preseljen u nove prostorije u kojima se nalazi i danas. U zgradu u ulici Stanka Paunovića (danas Generala Milojka Lešjanina) smešteno je istorijsko odeljenje pod nazivom Muzej NOB-a, a u zgradi bivše banke, u ulici Petog kongresa (današnja Nikole Pašića) izložena je stalna arheološka postavka. Godine 1951. osnovana je Umetnička galerija u Sinagogi, a naredne godine otvoreno je Memorijalno odeljenje „Mija Stanimirović”, čija je postavka skinuta 1957. godine. Stalna postavka Memorijalnog kompleksa „12. februar” otvorena je 1967. godine.
U ovom periodu načinjen je veliki iskorak u muzeološkoj prezentaciji, najviše zahvaljujući pomoći poznatih naučnih radnika iz Beograda, među kojima su prednjačili Đorđe Mano Zisi, Milutin Garašanin i Miodrag Grbić. Oni su inicirali formiranje nove stalne arheološke postavke 1965. godine.
Muzej u svojim fondovima danas ima preko 40.000 predmeta iz oblasti arheologije, numizmatike, epigrafike, istorije, istorije umetnosti i etnologije a poseduje i dve spomen-zbirke, Stevana Sremca i Branka Miljkovića. Posebnost Muzeja ogleda se u činjenici da se u njegovom sastavu nalaze i tri nepokretna kulturna dobra od izuzetnog značaja: arheološko nalazište Medijana, spomenik Ćele-kula i Memorijalni kompleks „12. februar”.