Srednjovekovna zbirka broji preko 800 predmeta koji potiču uglavnom iz Niša i okolnih sela, ali ima dosta predmeta i sa teritorije koja prevazilazi okvire današnje teritorijalne nadležnosti Muzeja.
Predmeti se datuju u širokom hronološkom rasponu od IV/V pa sve do XVI/XVII veka, kada se i datuje komplet zlatnog nakita, slučajni nalaz sa teritorije grada Niša. Načinom izrade i predstavom na njima posebno se ističu predmeti poput većeg relikvijara iz XII veka iz Oreovca kod Niša sa scenom Raspeća i figurom Bogorodice i vrh partizane (spontona), ceremonijalnog oružja pronađenog u neposrednoj blizini ruševina stare crkve u okolini Kuršumlije.